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紫外可見分光光度計(jì)法、原子吸收分光光度計(jì)等法樣品前處理方法

當(dāng)代科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，促使分析化學(xué)家在不斷地研究和改進(jìn)快速、、靈敏、能適合于各種不同體系的分析方法的技術(shù)，特別是像環(huán)境、生物等綜合復(fù)雜的樣品體系、由于它們組成復(fù)雜，相互之間差別很大，這些樣品在自然條件下，受光、熱、電磁輻射、微生物等外界條件的作用，會發(fā)生諸如氧化、還原、光解、水解、生物降解等一系列變化，故體系不穩(wěn)定。為此，對這些樣品從采樣、保存、運(yùn)輸、處理、分析等操作過程中均有一系列特殊要求。這類樣品通常需要進(jìn)行預(yù)處理后才能進(jìn)行（紫外可見分光光度計(jì)法、原子吸收分光光度計(jì)法）等分析。否則不僅得不到可靠的數(shù)據(jù)，而且還會污染檢測系統(tǒng)，影響儀器性能。所以樣品預(yù)處理已構(gòu)成分析化學(xué)的重要組成部分。

  一個(gè)完整的樣品分析過程包括從采樣開始到寫出報(bào)告大致可分為以下五個(gè)步驟：1.樣品采集；2.樣品處理；3.分析測定；4.數(shù)據(jù)處理；5.報(bào)告結(jié)果。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，上述五個(gè)步驟中各步所需的時(shí)間相差甚多，通常分析一個(gè)樣品只需幾分鐘至幾十分鐘，而樣品處理卻要幾個(gè)小時(shí)，甚至幾十小時(shí)。因而樣品前處理方法與技術(shù)的研究引起了廣大分析化學(xué)家的關(guān)注。

從環(huán)境、生物體中采集的樣品一般都不允許未經(jīng)處理直接進(jìn)行分析。

樣品前處理的目的是：1.濃縮痕量的被測組分，提高方法的靈敏度，降低小檢測限；2.消除基體與其他組分對測定的干擾；3.通過愆生化處理，使一些在常用檢測器上無響應(yīng)或低響應(yīng)值的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為高響應(yīng)值的愆生物；愆生化還用于改變基體或其他組分的性質(zhì)，提高它們與被測物的分離度，改進(jìn)方法的選擇性；4.使樣品便于保存和運(yùn)輸，如水樣通過短的吸附柱，使被測組分吸附，不但縮小樣品體積，便于運(yùn)輸，而且使被測組分保存穩(wěn)定，易于保存；5.除去對分析系統(tǒng)有害（如強(qiáng)酸或強(qiáng)堿性物質(zhì)、生物大小分子等），以延長儀器的使用壽命。

評價(jià)所選擇的前處理方法好壞的主要準(zhǔn)則是：1.能否大限度地影響測定的干擾物質(zhì)。2.被測組分的回收率是否高，如果回收率不高，會導(dǎo)致測定結(jié)果差，影響方法的靈敏度和精密度。3.操作是否簡便，步驟越多越繁瑣，不僅浪費(fèi)時(shí)間與精力，而且往往導(dǎo)致樣品損失越多，終的誤差也越大。4.成本是否低廉，避免使用貴重的儀器和試劑。5.對人體及生態(tài)環(huán)境是否有不良影響，不用或少用對環(huán)境有污染或影響人體健康的藥品試劑。

經(jīng)典的樣品前處理方法多達(dá)數(shù)十種，但用得較多的只有十幾種，表8-38列出了這些適用范圍。

幾種主要的經(jīng)典樣品前處理方法

方法                 原理                          適用范圍

物理方法            

吸附                吸附能力強(qiáng)弱不同                氣體、液體及可溶的固體

離心                相對分子量或密度不同             不同相態(tài)或相對分子質(zhì)量有差別的物質(zhì)

透析                滲透壓不同                       分子與離子或滲透壓不同的物質(zhì)

蒸餾                沸點(diǎn)或蒸氣壓的不同               各種液體

過濾                顆粒或分子大小的不同              液固兩相分離

液-液萃取           在兩種互不相溶液體中分配系數(shù)不同     各種在兩種液體溶解度差別較大的物質(zhì) 

冷凍干燥             蒸氣壓的不同                        在常溫下易于失去生物活性的物質(zhì)

柱層析              溶質(zhì)與固定相作用力的不同             氣體、液體和可溶的固體

索式萃取            不同溶劑中溶解度不同                  從固體、半固體中提取有機(jī)物質(zhì)

真空升華            蒸氣壓的不同                          從固體中分離可溶物質(zhì)

超聲振蕩            不同溶劑中溶度積不同                  從固體中分離可溶物質(zhì)

化學(xué)方法       

愆生              通過化學(xué)反應(yīng)改變?nèi)苜|(zhì)性質(zhì)、提高靈敏度及選擇性     能與愆生化試劑作用的化合物

沉淀              不同溶劑中溶度積不同                       與沉淀劑發(fā)生反應(yīng)生成沉淀的物質(zhì)

絡(luò)合   使干擾物生成絡(luò)合物，除去對被測組分測定的干擾    各種與配位體反應(yīng)的金屬離子或其他物質(zhì)。

對于各種方法與技術(shù)，根分析同的和對分析的具體要求，采取不同步驟收集不同成分。如痕量雜質(zhì)分析應(yīng)收集雜質(zhì)，而純物質(zhì)的結(jié)構(gòu)測定應(yīng)收集主要組分等。

• 蒸餾法

蒸餾是用得多，也是廣泛使用的樣品純化方法之一。尤其適用于有機(jī)化合物，包括在常溫下的液體和低熔點(diǎn)的固定，它是根據(jù)物質(zhì)相對揮發(fā)度的不同加以分離的。參見第九章第三節(jié)。

蒸餾法可分為以下七種。

1. 常壓蒸餾   常壓蒸餾又分為簡單蒸餾與分餾。簡單蒸餾又稱一步蒸餾。分餾也稱分步蒸餾，可看作一系列簡單蒸餾組成，因此分餾的效率通常要比一步蒸餾高的多。
2. 減壓蒸餾  是在低于大氣壓下進(jìn)行的蒸餾與分餾。它特別適用于那些沸點(diǎn)較高或熱不穩(wěn)定的化合物。因?yàn)榉蛛x度通常隨壓力降低而增大，所以對一些物質(zhì)還能提高它們的相對分離度。
3. 蒸汽蒸餾  是用一種惰性氣體或與被蒸餾組分互不相溶的蒸汽流過被蒸餾的液體，使其隨之汽化，混合成蒸汽流進(jìn)入冷卻系統(tǒng)變成液體。用于產(chǎn)生蒸汽的介質(zhì)必須是與被蒸餾物質(zhì)不互溶，相對分子質(zhì)量小，沸點(diǎn)低，比熱容大、不發(fā)生反應(yīng)的惰性物質(zhì)，而且價(jià)廉易得。在符合這些條件的物質(zhì)中水是理想的、也是常見的物質(zhì)，尤其適用于大多數(shù)有機(jī)物，因此蒸汽蒸餾通常也稱作水蒸汽蒸餾。

由于產(chǎn)生蒸汽流介質(zhì)的沸點(diǎn)低于被蒸餾物質(zhì)的沸點(diǎn)，因此蒸汽蒸餾處理樣品時(shí)的溫度一般低于樣品組成的沸點(diǎn)，從而使其具有類似減壓蒸餾的優(yōu)點(diǎn)，主要用于分離熱不穩(wěn)定的有機(jī)物。

（4）共沸蒸餾  是通過把一種稱為共沸溶劑的物質(zhì)加到樣品中，使它與所需的組分生成共沸物進(jìn)行蒸餾的過程。由于共沸物的沸點(diǎn)通常低于原始物質(zhì)，因而蒸餾可以在較低的溫度下進(jìn)行。

   共沸蒸餾中的一個(gè)重要問題就是正確選擇共沸溶劑。合適的共沸溶劑通常需要符合以下幾個(gè)條件：1.共沸點(diǎn)要比被蒸餾的組分低10~40℃。2.應(yīng)與理想狀態(tài)具有顯著的正偏差，以便與被蒸餾成分形成沸點(diǎn)低的低共沸物質(zhì)。3.在蒸餾與回流溫度下應(yīng)與被蒸餾物質(zhì)充分互溶。4.經(jīng)蒸餾后的低共沸物質(zhì)，很容易除去共沸溶劑，使產(chǎn)物恢復(fù)其原始組成。

（5）萃取蒸餾   是一種萃取與蒸餾結(jié)合的過程。萃取蒸餾需要在蒸餾原液中加入一種沸點(diǎn)比蒸餾原液高的物質(zhì)-萃取劑，生成的萃取物往往在裝置的底部。萃取蒸餾過程中，蒸餾原液中各組分的分子受熱逸出，自下而上進(jìn)入蒸餾柱，而萃取劑自蒸餾柱頂部加入，逆流而下，他們與原液中各組分的分子連續(xù)接觸，進(jìn)行有選擇地萃取，根據(jù)分子類型不同，把所需的組分從蒸餾物中分離出來。

（6）固相蒸餾  又稱升華，是指由固體直接轉(zhuǎn)化為氣體而不出現(xiàn)液體的過程。這種過程必須在低于該物質(zhì)三相點(diǎn)的條件下進(jìn)行。從而提高固體物質(zhì)的蒸發(fā)速率。加熱是提高生化速度的另一途徑，但溫度一般低于該物質(zhì)的熔點(diǎn)以下30℃。因此，升華技術(shù)特別適用于制備與分離那些受熱易分解或必須在較低溫度下處理的物質(zhì)。

（7）萃取升華  是在升華過程中通入惰性氣體，使被升華物質(zhì)的分子隨惰性氣體分子一起逸出，然后冷卻為固體。這種方式，與水蒸汽蒸餾相似。

色譜法（薄層析和柱層析）

色譜法是樣品制備與前處理中常用方法之一，有關(guān)各種色譜法原理、裝置、操作方法與應(yīng)用等參見十九章、第二十章及第二十一章。

根據(jù)流動相的不同，色譜法可以分為氣相色譜儀、液相色譜和介于兩者之間的超臨界流體色譜。

常用的展開方式以前沿展開與洗脫展開為主，而置換展開較少采用。前沿展開可用于濃縮被測的微量組分，也可用于除去微量組分。洗脫展開主要用于選擇性分離某一種或幾種所需的組分。需要注意的是柱色譜用于樣品處理時(shí)，通常色譜柱的負(fù)荷超過它的線性容量范圍，它是處于非線性色譜的工作狀態(tài)，因而對操作參數(shù)的選擇應(yīng)與通常做定量分析時(shí)的考慮有所不同。

樣品前處理中的色譜固定相填料在氣相色譜中以吸附劑為主，在液相色譜中除吸附劑外還有還有化學(xué)鍵合填料，通常為正構(gòu)烷基C8、C18等、離子交換劑、疏水作用填料、親和作用填料等。與近代液相色譜填料不同的是這類填料一般顆粒較大、分布較寬，通常在低壓下使用，因而仍屬低壓色譜或經(jīng)典色譜儀的范疇。色譜柱通常是幾厘米至幾十厘米長的玻璃管或聚乙烯、聚丙烯塑料管。固定相顆粒用常規(guī)重力振蕩填充，不需液相色譜均漿裝柱設(shè)備，樣品從柱頂部加入，靠流動相的重力進(jìn)行展開，或在柱出口端接負(fù)壓，加快展開速度。

常用的主要固定相填料，如氧化鋁、硅膠、硅藻土、活性炭、分子篩、離子交換劑等的使用、活化及其他注意事項(xiàng)，參見第十九章節(jié)。化學(xué)鍵合固定相參見第二十一章第三節(jié)。

氣相色譜法用于樣品制備與前處理的對象主要是氣體樣品，而且常用前沿展開技術(shù)，讓樣品本身作為流動相通過填充了吸附劑的色譜柱，使樣品中痕量組分（雜質(zhì)）吸附在填料上，再用溶劑洗脫吸附的痕量組分（雜質(zhì)）進(jìn)行分析。此法在超純氣體中雜質(zhì)的分析及環(huán)境大氣質(zhì)量的評價(jià)中得到廣泛應(yīng)用。

使用前沿展開法時(shí)必須注意被分離組分在填料上的柱容量，它不僅與被分離組分的色譜行為有關(guān)，而且也隨樣品中其他組分的多少及他們的色譜行為而變化。不掌握這些性質(zhì)就無法大限度地利用柱填料的分離能力，取得好的處理效果。

柱色譜法處理樣品時(shí)，由于固定相顆粒來源不同，批號不同，同類填料的理化性能會有大的差異，加上活化方法不同，填充方式又因人而異，所以樣品制備與前處理結(jié)果的重現(xiàn)性與可比性均較差。目前已有商品柱供處理樣品用，因而發(fā)展成一種專門的樣品前處理方法，即固相萃取法。

   共沉淀法

在痕量組分和常量組分的溶液中，當(dāng)常量組成形成沉淀時(shí)，通常還未達(dá)到溶度積的痕量組分也隨之析出沉淀的現(xiàn)象。這時(shí)由常量組分形成的沉淀稱為載體，載體可以是原來試樣中的基體成分，也可以是外加的特定物質(zhì)，需根據(jù)共沉淀的要求選擇。生物材料痕量分析中常從兩方面利用共沉淀；使待測成分從溶液中析出，或使特定干擾從溶液中除去。前者也起富集作用，應(yīng)用較廣。

共沉淀的體系和作用特點(diǎn)

1. 共沉淀體系  約有70多種金屬離子可用不同的載體共沉淀，它們常用于生物體液中痕量成分的富集和分離。

 常見的無機(jī)共沉淀劑有：

PH 3~8時(shí)生成的氫氧化鋅可分離As（III，V）、AI（III）、Nb（V)、 Ta(V） 、W（VI）。

在硝酸介質(zhì)中由高錳酸鉀（鹽）和硝酸錳溶液加熱生成的二氧化錳，可使Sb（III）、Bi(III)、 Sn（IV)、 Pb(II)、 TI（III）、 Au（III）共沉淀。

 在PH3.2~9.5生成的氫氧化鐵，可載帶多種陰、陽離子如AI（III)、Cr(III)、 Ti(III,IV)、 Hf(IV)、 U（IV）、 As(V）、 Mo（V）、 Se(IV,VI)等共沉淀析出。

鐵、鋅、鎘的硫化物在微酸性或中性介質(zhì)中，可將Hg、 Cu、 Ga、 In等很好載帶。

常用的有機(jī)共沉淀劑可分為兩類：一類是過量試劑作為本身參與組成目標(biāo)組分的絡(luò)合物載體；另一類是試劑僅作為載體而不參與絡(luò)合物的形成。通常以前者較多，又可分為簡單螯合物體系如8-羥基喹啉的載帶各種金屬離子的相應(yīng)螯合物，以及離子型絡(luò)合物和其他三元或多元絡(luò)合物體系，如海水中10-9級的銀、鈷、鉬等可被8-羥基喹啉和二乙氨基二硫代甲酸鹽及酚酞等形成螯合物陽離子與有機(jī)陰離子的多元螯合-締合體系共沉淀。

（2）共沉淀作用的特點(diǎn)  它的一個(gè)顯著特點(diǎn)是不要求制備純的沉淀物或沉淀*，而只期望能充分富集痕量組分。在操作上共沉淀時(shí)并不需要將沉淀與溶液定量分離，可在沉淀沉降后傾瀉潷出上層澤液，簡化了通常過濾繁瑣步驟。還有另一優(yōu)點(diǎn)，可以在沉淀后去除沉淀劑。如許多有機(jī)共沉淀劑在富集了痕量成分后，可用灼燒或溶解除去，從而進(jìn)一步消除了基體干擾，改善富集效果。

2.共沉淀的分類和作用機(jī)理

共沉淀按其對組分的化學(xué)作用可為混晶、吸附和共結(jié)晶等幾類。

1. 混晶 指痕量成分（或雜質(zhì)）分布在常量物質(zhì)或基體沉淀的晶體內(nèi)部。如，在含痕量Pb2+的試樣液中，加入Ba(NO3)2,然后加過量沉淀劑硫酸，Pb2+就能與載體BaSO4生成混晶Ba(Pb)SO4從溶液中析出，形成混晶共沉淀。若兩種鹽（基體沉淀和待分離成分）屬相同的晶系，離子電荷相同，并且離子大小相差不超過10%~15%時(shí)，則沉淀中的一種離子可被外來離子取代，也就是形成固體溶液或稱固體溶體。這過程分均勻摻雜和摻差摻雜兩種情況，前者指沉淀迅速重結(jié)晶，后者指固體不進(jìn)行重結(jié)晶，緩慢增大。
2. 吸附 指痕量成分分布于常量物質(zhì)沉淀顆粒的表面，如氫氧化鋁的膠體沉淀以其巨大表面吸附雜質(zhì)。

   吸附與膠體的應(yīng)用關(guān)系密切。膠體通常指直徑10-7~10-4cm范圍內(nèi)的顆粒，估計(jì)每個(gè)這樣的顆粒含10²~10 4cm 范圍內(nèi)的顆粒，估計(jì)每個(gè)這樣的電解質(zhì)的絮凝作用很敏感，且凝聚過程不可逆，既不會在稀釋時(shí)再分散，他們又稱溶膠，如碘化銀、硫化砷等，黏度低；后者則稱為乳膠，蛋白質(zhì)和淀粉是其典型物，粘性強(qiáng)，對電解物的凝聚作用不敏感，又稱親液膠體。在生物試樣制備和處理中，后一類更為重要。但在雜質(zhì)分離中，前者很實(shí)用。

在膠粒聚沉形成膠團(tuán)時(shí)，痕量組分包在膠團(tuán)中，稱作包藏。通常認(rèn)為膠體沉淀的吸附基本上是物理作用，不要求共沉淀組分與沉淀基體結(jié)構(gòu)相匹配，因而選擇欠佳，多種雜質(zhì)均能被載帶，其性質(zhì)相差甚遠(yuǎn)的成分亦能被吸附，例如氫氧化鐵吸附尿液中的痕量碘（I)、氫氧化鋅吸附尿液及某些廢液中十多種雜質(zhì)，并非由于化學(xué)性質(zhì)相似。

（3）共結(jié)晶   與混晶共沉淀相似但實(shí)質(zhì)有異。這是利用沸點(diǎn)較低的水溶性有機(jī)溶劑預(yù)先溶解某些有機(jī)螯合劑，然后加入試樣溶液，使待測成分形成絡(luò)合物晶體。通常這類絡(luò)合物的晶形與試劑的晶形相似，當(dāng)加熱使有機(jī)溶劑蒸發(fā)時(shí)，原來的螯合劑晶體將析出，并把痕量成分的絡(luò)合物載帶下來，這就是共結(jié)晶的實(shí)質(zhì)。

四．重結(jié)晶

重結(jié)晶是一種從溶液中析出固體的過程。一般在低溫下進(jìn)行，特別適用于熱敏化合物的分離與純化，蒸汽壓接近的物質(zhì)，以及光學(xué)非對映異構(gòu)體的分離。還用于濃縮溶液，避免揮發(fā)性成分的損失，減少對容器的污染。它的應(yīng)用對象極廣，參見第九章節(jié)。

1. 重結(jié)晶步驟  首先把不純物溶解在合適的溶劑中，溶解時(shí)的溫度根據(jù)溶質(zhì)的性質(zhì)而定。對于溶解度隨溫度升高的物質(zhì)，一般在接近溶劑沸點(diǎn)的溫度下進(jìn)行溶解，并不斷震蕩使溶液接近飽和狀態(tài)，然后趁熱迅速過濾，除去不溶的固體微粒。為防止過濾過程中由于冷卻析出晶體，可以使用加熱漏斗。再把過濾后的溶液冷卻，使溶質(zhì)晶體析出，析出的晶體可用離心分離或過濾，與母液分離，通過離心分離比過濾更具有*性，特別是分離細(xì)微晶體，不僅效率高，操作方便，而且比過濾速度快的多。后用少量新鮮的冷溶劑洗滌分離后的晶體，不僅效率高，操作方便，而且比過濾速度快得多。后用少量新鮮的冷溶劑洗滌分離后的晶體，除去晶體表面的母液并加以干燥。
2. 重結(jié)晶過程中溶劑的選擇   合適的溶劑必須符合以下幾個(gè)條件：1.重結(jié)晶的物質(zhì)在高溫和低溫下的飽和溶解度有明顯的差別，差別越大，收率越高；2.易使重結(jié)晶的物質(zhì)形成晶體；3.溶劑本身容易從晶體中除去；4.與晶體不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；5.易揮發(fā)而不可燃。此外相似的規(guī)則、理化性質(zhì)、同系物的碳數(shù)規(guī)則等對溶劑選擇也有指導(dǎo)意義。若單一溶劑不適合時(shí)，可選用混合溶劑。

用混合溶劑重結(jié)晶時(shí)先將溶質(zhì)溶于易溶溶劑中，若加溫有利于溶解可以加熱，再加入熱的第二溶劑，直至溶液渾濁或析出晶體。再加幾滴種溶劑使溶液變清，趁熱過濾后馬上冷卻，讓晶體析出。這里需要強(qiáng)調(diào)的是混合溶劑只是在沒有合適的單一溶劑時(shí)不考慮使用混合溶劑。

靜態(tài)吸附法

這里指固、液兩相，特別是作為吸附劑的固相處于相對靜止?fàn)顟B(tài)的一類吸附方法，可粗分為筒單物理-化學(xué)吸附、離子交換和絡(luò)合作用三類。

1. 簡單物理-化學(xué)吸附

常用的固定相有活性炭、硅膠、氧化鋁、白土、分子篩、纖維素等，廣泛地用于生物材料痕量分析。它們的特點(diǎn)是其表面未經(jīng)化學(xué)改性，吸附機(jī)制屬一般物理化學(xué)作用。

1. 活性炭  為非極性吸附劑，較易吸附極性極小的分子。通?？捎糜诿撋?，例如吸附菜蔬果汁中的色素，亦可用于去味和去氣體，對NO3-、NO2-也有相當(dāng)吸附能力。主要有骨炭和木炭兩類。骨炭是用獸骨經(jīng)脫脂及熱處理制成，主要成分為磷酸鈣。木炭由鋸木、煤粉、糖、海草等含炭植物與硅藻土或浮石，以及其他不溶鹽類混合加熱后，有機(jī)物分解而將炭沉積于多孔的無機(jī)物上面而得，其中木炭較常用。商品活性炭的比表面約為100~1000㎡/g，用前需經(jīng)分篩，其粒度小于90um的約占92%，表面積約為800㎡/g，此種活性炭50mg足以富集100ug痕量成分。
2. 硅膠  由硅酸的膠狀沉淀部分脫水時(shí)形成的一種多孔性物質(zhì)。其吸附性由于其表面含有硅醇基Si-OH,可與極性化合物或其他適宜的不飽和化合物形成氫鍵，故對極性物如水強(qiáng)烈吸附，是優(yōu)良去水劑，廣泛用于油脂分析及石油組分分析。硅酸呈酸性PKA1，10；PKA2，12。
3. 氧化鋁  氧化鋁活性在于表面吸附表層水形成鋁羥基AI-OH，具有形成氫鍵的能力，一般略帶堿性。常用于脫色或使蛋白質(zhì)聚沉，或使膠態(tài)物凝聚，適用于堿性和中性介質(zhì)，并可活化反復(fù)再用。
4. 白土 又稱漂白土，主要用于除去動、植物油中的惡臭、異味及顏色，其主要成分是氧化硅和氧化鋁，因而具有兩者的特點(diǎn)。天然白土組成相當(dāng)于5SIO2。AL2O3，約含有50%~60%的水分，孔隙率達(dá)60%~70%，比表面120~140㎡/g，能吸附自重12%~15%的有機(jī)物質(zhì)。生物材料分析中用于漂白，使動、植物體液及漿汁中的蛋白質(zhì)聚沉。白土浸于水中時(shí)，PH為6.5~7.5.
5. 分子篩   又名沸石，是一種金屬硅鋁酸鹽晶態(tài)礦物質(zhì)，其晶體結(jié)構(gòu)基本上是由SiO4和ALO4四面體的三維骨架構(gòu)成的。含鋁的四面體為負(fù)電性，晶體中包含的金屬陽離子平衡該負(fù)電。當(dāng)沸石脫水時(shí)，其晶體呈蜂窩結(jié)構(gòu)，但四面體骨架不變，且其中的空穴呈規(guī)則排列，空穴間有分子大小的孔道交聯(lián)。